Una sequenza genetica può essere composta da centinaia o migliaia di basi. Un’analisi qPCR può restituire una curva di amplificazione. Una digital PCR può fornire il numero di copie di un determinato target presenti nella reazione.
Nessuno di questi risultati, considerato isolatamente, risponde però alla domanda iniziale.
La sequenza deve essere confrontata con riferimenti attendibili. Il segnale di amplificazione deve essere valutato insieme ai controlli. Il numero di copie deve essere interpretato considerando il campione, il metodo di estrazione, il volume analizzato e le caratteristiche della matrice.
Il risultato prodotto dallo strumento è quindi soltanto una parte del percorso. Il vero obiettivo è trasformarlo in un’informazione comprensibile, verificabile e utilizzabile per prendere una decisione.
Le sequenze come risorsa digitale
La FAO utilizza l’espressione Digital Sequence Information, o DSI, per affrontare il ruolo delle informazioni digitali derivate dalle risorse genetiche. Non esiste ancora una definizione universalmente condivisa del termine, ma il concetto comprende, in senso generale, le informazioni associate alle sequenze di DNA e RNA conservate e utilizzate in formato digitale.
Questi dati hanno assunto un ruolo centrale nella ricerca biologica e ambientale. Possono contribuire all’identificazione tassonomica, allo studio delle risorse genetiche, alla gestione delle specie minacciate, al riconoscimento dell’origine dei prodotti e alla pianificazione degli interventi di conservazione.
La loro utilità deriva soprattutto dalla possibilità di confrontare dati prodotti da laboratori, progetti e Paesi differenti. Un campione analizzato oggi può essere confrontato con sequenze depositate anni prima o con nuovi riferimenti che saranno resi disponibili in futuro.
Perché ciò sia possibile, però, una sequenza non deve essere separata dalle informazioni che ne descrivono l’origine.
Una sequenza senza contesto racconta poco
Il valore di un dato genetico dipende dai metadati che lo accompagnano.
Tra le informazioni più importanti possono rientrare:
- l’organismo o la matrice di provenienza;
- * il luogo e la data del campionamento;
- * la parte dell’organismo analizzata;
- * il metodo di identificazione iniziale;
- * il marcatore genetico utilizzato;
- * la qualità e la lunghezza della sequenza;
- * la disponibilità di un campione o voucher di riferimento;
- * le procedure di laboratorio e bioinformatiche applicate;
- * i controlli eseguiti durante l’analisi.
Una sequenza associata a un campione correttamente identificato, documentato e conservato può diventare un riferimento utile. La stessa sequenza, priva di informazioni sulla provenienza o attribuita a un organismo identificato in modo incerto, può invece generare nuove ambiguità.
La costruzione di database affidabili non consiste quindi soltanto nell’accumulare un numero crescente di sequenze. Richiede il collegamento tra dato molecolare, campione biologico, identificazione tassonomica e informazioni ambientali o geografiche.
Il confronto con i database
Nel DNA barcoding, la sequenza ottenuta viene confrontata con quelle già disponibili nelle banche dati.
Tra le risorse maggiormente utilizzate figurano BOLD Systems e NCBI/GenBank, che hanno caratteristiche differenti.
BOLD è una piattaforma specificamente sviluppata per il DNA barcoding e integra sequenze, dati tassonomici e, quando disponibili, informazioni sui campioni di riferimento. GenBank è invece un archivio molto più ampio, che raccoglie sequenze nucleotidiche provenienti da tutti i settori della ricerca biologica.
La grande copertura di questi database rappresenta una risorsa fondamentale, ma il confronto non può essere interpretato come una risposta automatica.
Un’elevata percentuale di identità indica che la sequenza analizzata è molto simile a una o più sequenze di riferimento. Non dimostra, da sola, che l’attribuzione tassonomica sia necessariamente corretta.
Per interpretare il risultato è necessario valutare anche:
- * la copertura dell’allineamento;
- * la qualità della sequenza;
- * il potere discriminante del marcatore;
- * il numero e la coerenza dei riferimenti disponibili;
- * la presenza di specie strettamente affini;
- * la concordanza tra marcatori differenti;
- * l’affidabilità dell’identificazione associata alle sequenze di riferimento;
- * l’eventuale presenza di ibridi o fenomeni di introgressione.
Una corrispondenza del 99 o del 100 per cento può essere molto informativa in alcuni gruppi tassonomici e non sufficiente in altri. Allo stesso modo, due specie differenti possono condividere la stessa sequenza nella regione analizzata.
Il dato deve essere letto all’interno del contesto biologico e tassonomico, non soltanto attraverso il valore percentuale restituito dal software.
Tutto parte dalla domanda
La qualità dell’interpretazione dipende anche da come è stata formulata la domanda analitica.
“Che cosa contiene questo campione?” può significare cose molto diverse:
- * identificare un singolo organismo;
- * cercare una determinata specie;
- * descrivere tutte le specie rilevabili in una miscela;
- * distinguere varietà della stessa specie;
- * verificare l’origine geografica di un materiale;
- * stabilire se un organismo sia vivo o se un’infezione sia attiva;
* quantificare la presenza di un determinato target.
Non tutte queste domande possono essere affrontate con la stessa tecnologia e, in alcuni casi, il DNA non può fornire da solo la risposta richiesta.
Il DNA barcoding è adatto principalmente all’identificazione tassonomica di un campione. Il metabarcoding permette di analizzare matrici che contengono DNA proveniente da più organismi. qPCR e digital PCR cercano in modo mirato una determinata sequenza. Gli studi sulla diversità tra popolazioni richiedono marcatori intraspecifici o analisi genomiche.
Anche la matrice condiziona il risultato. Un tessuto fresco, una farina, un estratto vegetale e un campione di acqua ambientale contengono quantità e qualità di DNA molto differenti. Processi industriali, calore, fermentazione, raffinazione e conservazione possono degradare il materiale genetico fino a rendere alcune domande non più affrontabili.
La corretta impostazione dell’analisi deve quindi precedere il lavoro di laboratorio.
Il ruolo dei controlli
Un risultato è affidabile solo se i controlli permettono di verificare il corretto funzionamento dell’intero processo.
I controlli negativi aiutano a individuare eventuali contaminazioni introdotte durante il campionamento, l’estrazione o l’amplificazione. I controlli positivi verificano che il sistema analitico sia in grado di rilevare il target. I controlli di amplificabilità possono evidenziare la presenza di sostanze inibenti o di DNA troppo degradato.
Nel metabarcoding, inoltre, la composizione finale dei dati può essere influenzata dai primer, dall’efficienza di amplificazione, dalla profondità di sequenziamento e dalle soglie utilizzate nell’analisi bioinformatica.
L’assenza di un segnale non equivale quindi sempre all’assenza dell’organismo. Potrebbe indicare che il DNA non era presente nella porzione analizzata, che era troppo degradato oppure che il metodo non era sufficientemente sensibile per quel campione.
Anche in questo caso il risultato deve essere accompagnato da una spiegazione di ciò che il metodo è stato effettivamente in grado di verificare.
Un dato utile deve dichiarare anche i propri limiti
Un rapporto analitico dovrebbe distinguere chiaramente:
- * ciò che è stato osservato;
- * il metodo con cui è stato ottenuto;
- * l’interpretazione supportata dai dati;
- * le conclusioni che non possono essere tratte;
- * gli eventuali approfondimenti necessari.
Questa trasparenza non indebolisce il risultato. Al contrario, permette a chi lo utilizza di comprenderne il reale significato.
Nelle attività di identificazione, autenticazione e monitoraggio sviluppate da FEM2, la scelta del metodo viene quindi costruita partendo dalla decisione che il cliente o il responsabile del progetto deve prendere. La domanda non è soltanto “quale analisi possiamo eseguire?”, ma “quale informazione serve e quale metodo può produrla con un livello di affidabilità adeguato?”.
È questo passaggio che trasforma una sequenza, una curva di amplificazione o un numero di copie in uno strumento decisionale.
Dal campione alla conoscenza
Nel corso di questa rubrica abbiamo visto come le tecnologie molecolari possano contribuire alla conoscenza delle risorse genetiche vegetali, al monitoraggio degli ambienti acquatici e, più in generale, alla caratterizzazione della biodiversità di interesse alimentare e agricolo.
Il filo comune non è una singola tecnologia. È il percorso che collega il campione alla domanda, la domanda al metodo e il risultato alla sua interpretazione.
Il DNA può fornire informazioni estremamente precise, ma la precisione analitica non coincide automaticamente con la certezza biologica. Servono riferimenti affidabili, controlli, metadati, competenze tassonomiche e consapevolezza dei limiti.
Solo allora il dato genetico smette di essere una successione di basi o un segnale prodotto da uno strumento e diventa conoscenza utilizzabile.
Documenti e risorse
* [FAO – Digital Sequence Information]
